本期我们将系统解析CRISPR/Cas系统的编辑效率验证技术，帮助大家完成基因编辑实验的最后确认！
基因编辑效率，简单来说，就是成功实现目标基因编辑的细胞或样本占总细胞或样本的比例。这个比例直接反映了基因编辑工具的有效性，无论是用于科研探索，还是朝着基因治疗、生物制药等实际应用迈进，精准验证基因编辑效率都是必不可少的步骤。
T7核酸酶I
目前市面上最基础的基因编辑检测工具——T7核酸酶I（T7 Endonuclease I），它就像一位敏锐的“侦察兵”，作为核酸内切酶能够特异性的识别并切割不完全配对的DNA序列(non-perfectly matched DNA)。常用于ZFNs、TALENs、CRISPR/Cas9等导致的基因突变的鉴定。如果通过基因编辑技术成功获得了插入或缺失的突变基因序列，那么当基因编辑后的DNA与野生型DNA放在一起时，将其变性再退火复性，野生型的DNA单链和基因编辑后的DNA 单链会错配形成异源双链DNA结构。此时，加上T7核酸内切酶I就可以特异性的识别错配的异源双链DNA并在错配位点附近进行切割。通过琼脂糖凝胶电泳即可显示酶切后的条带，确认基因编辑效率的有效性。
近岸蛋白的T7 Endonuclease I（Cat.No.:M017）能有效检测ZFNs、TALENs、CRISPR/Cas9等基因编辑之后形成的突变体，识别切割效率高，是基因编辑检测的不二之选！
产品用途
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基因突变和SNP的检测，可应用于TALEN、CRISPR/Cas9基因编辑形成的突变体检测； -
识别错配DNA，分解四方向交叉DNA或分支DNA； -
检测或切割异源二聚体DNA和切割DNA； -
随机切割线性DNA进行shot-gun克隆。
产品性能
01 突变体检测效果好
图例）T7EI法检测突变体。泳道1：野生型条带700bp； 泳道2：突变型条带700bp； 泳道3：野生型条带与突变型条带退火，产生T7EI切割条带300bp+400bp。
02 有效切割电转后的突变体
图例）将不同Cas9/sgRNA RNP复合物通过电转方式递送至293T细胞，48h后收集细胞，抽提基因组DNA。使用T7EI（Cat#M017）检测，结果表明相同条件下，近岸蛋白的Cas9蛋白切割效率要优于其他同类品牌。同时证明T7EI有效检测基因编辑效率。
操作步骤
1.取转染后的细胞培养48~72h；
2.收集细胞，提取细胞的基因组（突变体DNA）；
3.使用高保真PCR（2×Fast Pfu Master Mix (Quick Load)，Cat.No.: E035）分别以突变体DNA和野生型DNA为模板，扩增靶基因编辑的区域；
注：突变位点避免位于片段中间，便于区分切割后的条带
4.变性退火PCR产物
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反应体系
组分 投入量 10×T7 Endonuclease I Reaction Buffer 1μl PCR产物（野生型：突变型=1:1） 0.3μg RNase Free Water Up to 9.5μl -
反应条件
温度 时间 95℃ 5min 95℃-85℃ -2℃/sec 85℃-25℃ -0.1℃/sec 16℃ 2min -
T7EI酶切反应
当PCR结束后，在PCR产物中加入0.5μl T7EI酶，37℃保温15-30min，立即加入DNA loading buffer终止反应，混匀后65℃保温10min，琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。
基因编辑检测相关产品推荐
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PCR一代测序法（Sanger法）
在基因编辑过程中会在靶基因引入插入或缺失，直接提取基因组DNA，扩增靶基因附近片段，通过PCR一代测序法鉴定，如果被编辑后的位点检测到双峰或者杂峰，则表示产生了有效的基因编辑。
NGS高通量深度测序法
近岸蛋白有适配NGS测序的多种通用型接头可供选择：
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NovoNGS® DNA Adapters Set1–Set2 for Illumina® |
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质谱分析法
质谱分析法的核心在于测定生物分子质荷比来分析其结构。在基因编辑检测时，先将基因编辑后的细胞或组织样本提取蛋白质，经纯化、酶解处理成肽段混合物。通过电喷雾离子化（ESI）或基质辅助激光解吸离子化（MALDI）等方式，使肽段转化为气态离子。离子束进入质量分析器，在电场和磁场作用下，不同质荷比的离子发生分离，例如在飞行时间质量分析器中，离子依飞行时间差异确定质荷比。最后得到质谱图，将其与数据库中已知蛋白质质谱图比对，分析肽段质荷比、相对丰度等信息，推断蛋白质氨基酸序列。由于基因编辑会改变蛋白质编码序列和一级结构，通过对比质谱图变化，可间接反映基因编辑对蛋白质的影响，评估基因编辑效果 。
流式细胞术
流式细胞术是基于细胞光学特性与荧光标记的检测技术。当基因编辑后的细胞样本制成单细胞悬液后，在压力驱动下，细胞依次通过流动室与激光束相交。细胞受激光激发产生荧光，同时会产生散射光，前向散射光与细胞大小相关，侧向散射光与细胞内部结构复杂度有关 。如果基因编辑使细胞表达特定标记蛋白，标记特异性抗体与目标蛋白结合后，细胞携带荧光信号。光学系统收集这些荧光和散射光信号，荧光检测器（光电倍增管）和散射光检测器（光电二极管）将光信号转化为电信号。通过对这些信号的分析，如绘制荧光强度与细胞数量的直方图等，能够计算出基因编辑成功表达目标蛋白的细胞比例，实现对细胞群体的多参数、定量分析 。
下一期，我们将聚焦基因编辑实验操作过程中脱靶问题的解决方案，从优化编辑工具到调整实验条件，手把手教你提高基因编辑实验的成功率！记得持续关注，一起在基因编辑的道路上披荆斩棘！
近岸蛋白能提供基因编辑系列产品的全套解决方案，各位小伙伴可以联系官方后台申请试用~
CRISPR/Cas系统相关产品推荐表
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